一种抗草甘膦棉花的快速鉴定方法，包括：将已露白的待测棉花种子用草甘膦溶液浸泡；清水冲洗后，将所浸泡过的种子置于光照培养箱中进行砂培；统计出苗数，计算出苗率；根据出苗率判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花。本发明的鉴定方法，克服了田间或温室鉴定周期长、工作量大、易受季节限制等缺点，具有很强的实用性和可操作性。
1.一种抗草甘膦棉花的快速鉴定方法，包括：xa0将已露白的待测棉花种子用草甘膦溶液浸泡，所述的浸泡包括用4.1～8.2gxa0a.i./L的草甘膦溶液浸泡1～2小时；xa0清水冲洗后，将所浸泡过的种子置于光照培养箱中进行砂培，所述砂培由以下步骤组成：将灭菌的细砂和水混匀，装入发芽盒中，将所述浸泡的步骤中浸泡过的种子均匀摆放于发芽盒中，然后在种子上覆盖松散砂，盖上盖子后置于光照培养箱中培养，其中发芽盒的尺寸为13cm×19cm×12cm；将灭菌的细砂和水按照重量比50：8～10的比例混匀；其中在种子上覆盖的松散砂厚1.5～2cm；其中，所述砂培的时间为7天；xa0统计出苗数，计算出苗率；xa0根据出苗率判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70％的为抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30％的为非抗草甘膦棉花。xa0
2.如权利要求1所述的方法，其中，xa0在所述浸泡的步骤中，将部分已露白的待测棉花种子用草甘膦溶液浸泡，将另一部分已露白的待测棉花种子用清水浸泡，其中清水浸泡的种子为对照；xa0在所述统计和计算的步骤中，统计出苗数和胚根长，计算出苗率和胚根生长抑制率；xa0在所述判断的步骤中，根据出苗率和胚根生长抑制率判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70％、胚根生长抑制率小于或等于30％的为抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30％、胚根生长抑制率大于或等于70％的为非抗草甘膦棉花。xa0
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，xa0在所述统计和计算的步骤中，还观察胚根生长情况；xa0在所述判断的步骤中，还根据胚根生长情况判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中胚根生长正常的为抗草甘膦棉花，而胚根生长受抑制、无侧根的为非抗草甘膦棉花。xa0
4.如权利要求2所述的方法，其中如果清水浸泡的种子的出苗率大于或等于70％，则鉴定有效；如果清水浸泡的种子的出苗率小于70％，则鉴定无效。xa0
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述浸泡的步骤中，所述的浸泡包括用8.2gxa0a.i./L的草甘膦溶液浸泡1小时。xa0
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述已露白的待测棉花种子是通过催芽处理得到的，其中，所述的催芽处理包括：取待测棉花种子于25℃～30℃清水中浸泡24～48小时，期间换水0～1次。xa0
7.如权利要求1所述的方法，其中，将灭菌的细砂和水按照重量比50：8的比例混匀。xa0
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述光照培养箱的设定条件为：温度28～30℃，湿度60％～80％，光照与黑暗比为8～14小时：16～10小时，光照强度6000～8000lx。xa0
9.如权利要求8所述的方法，其中，光照与黑暗比为8小时：16小时。xa0
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述的细砂灭菌方法包括：将细砂过筛后置于干燥箱中高温灭菌，在120～180℃下干热灭菌4～6小时。xa0
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述的草甘膦为农达，其含有41％草甘膦异丙胺盐。xa0技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体地说，涉及除草剂生物测定技术，更具体地说，涉及一种抗草甘膦棉花的快速鉴定方法。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物，常年种植面积500万hm²，占经济作物总面积的26%，是国民经济的重要支柱产业。然而，我国棉田杂草危害较重，常年造成损失在14%～16%，严重制约了棉花的优质、高效生产。草甘膦作为一种广谱内吸灭生性除草剂，在棉田杂草的防除中发挥着重要的作用。但是，由于草甘膦不具有在杂草和棉花之间的选择性，在使用草甘膦时，往往容易对常规棉花品种造成药害，甚至死亡。转基因抗草甘膦棉花的应用不仅可以避免药害的产生，还可以扩大草甘膦的使用范围和灵活性。自1997年美国率先开始种植转基因抗草甘膦棉花以来，抗草甘膦棉花在美国的种植面积占棉花总种植面积的比例从1997年的3.2%增加到2009年的70%左右。目前，我国正在实施转基因抗草甘膦棉花新品种培育计划，并且已经分离和鉴定了多个拥有自主知识产权的草甘膦高抗基因，并已经获得一批稳定表达的单抗草甘膦和具有抗草甘膦抗虫复合性状的转基因棉花新材料。随着农业现代化水平的提高，农村劳动力大量城市化转移，棉花生产对抗草甘膦品种的需求越来越强烈。转基因抗草甘膦棉花势必将成为我国继抗虫棉之后有望推广的另一类转基因棉花产业化品种。在抗草甘膦棉花品种选育过程中，对棉花材料进行草甘膦抗性评价不仅是棉花育种和产业化推广的基础，也是进行转基因棉花环境安全性评价的内容之一，因此，研究一种抗草甘膦棉花的检测和鉴定方法就显得尤为重要。目前，抗草甘膦棉花的鉴定方法主要为田间或温室植株抗性鉴定法，即在田间或温室种植待测棉花，当棉花长到一定叶龄后喷施一定浓度的草甘膦，根据施药后棉花植株的死亡程度对其是否为抗草甘膦棉花做出判断。此方法直观准确，但是耗时长、占用空间大、季节性强。分子和蛋白测定也是一种鉴定转基因抗草甘膦棉花的方法，但由于分子检测所需仪器和试剂昂贵，对检测人员的专业技术要求较高，多数公司和科研院所很难开展，另外，目前国内抗草甘膦棉花尚未商业化，外源基因尚未公布，分子检测方法受到限制。因此，建立一种快速、简便、低成本且准确有效的抗草甘膦棉花鉴定方法对于今后抗草甘膦棉花的推广和检测具有重要意义。
发明内容
本发明公开了一种抗草甘膦棉花的快速鉴定方法，包括：将已露白的待测棉花种子用草甘膦溶液浸泡；清水冲洗后，将所浸泡过的种子置于光照培养箱中进行砂培；统计出苗数，计算出苗率；根据出苗率判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%的为抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%的为非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，在所述浸泡的步骤中，可将部分已露白的待测棉花种子用草甘膦溶液浸泡，可将另一部分已露白的待测棉花种子用清水浸泡，其中清水浸泡的种子为对照；在所述统计和计算的步骤中，可统计出苗数和胚根长，可计算出苗率和胚根生长抑制率；在所述判断的步骤中，可根据出苗率和胚根生长抑制率判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%、胚根生长抑制率小于或等于30%的为抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%、胚根生长抑制率大于或等于70%的为非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，在所述统计和计算的步骤中，还可观察胚根生长情况；在所述判断的步骤中，还可根据胚根生长情况判断待测棉花是否为抗草甘膦棉花，其中胚根生长正常的为抗草甘膦棉花，而胚根生长受抑制、无侧根的为非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，其中如果清水浸泡的种子的出苗率大于或等于70%，则鉴定有效；如果清水浸泡的种子的出苗率小于70%，则鉴定无效。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，在所述浸泡的步骤中，所述的浸泡可包括用4.1～8.2ga.i./L的草甘膦溶液浸泡1～2小时，优选用8.2ga.i./L的草甘膦溶液浸泡1小时。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，所述已露白的待测棉花种子可以是通过催芽处理得到的，其中，所述的催芽处理可包括：取待测棉花种子于25℃～30℃清水中浸泡24～48小时，期间换水0~1次。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，在所述砂培的步骤中，所述的砂培可包括：将灭菌的细砂和水混匀，装入发芽盒中，将所述浸泡的步骤中浸泡过的种子均匀摆放于发芽盒中，然后在种子上覆盖松散砂，盖上盖子后置于光照培养箱中培养，其中优选发芽盒的尺寸为13cm*19cm*12cm；优选将灭菌的细砂和水按照重量比50：8～10的比例混匀，最优选按照重量比50：8的比例混匀；其中优选在种子上覆盖的松散砂厚1.5～2cm；其中，所述砂培的时间优选为7天。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，所述光照培养箱的设定条件可为：温度28～30℃，湿度60%～80%，光照与黑暗比为8～14小时：16～10小时，优选为8小时：16小时，光照强度6000～8000lx。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，所述的细砂灭菌方法可包括：将细砂过筛后置于干燥箱中高温灭菌，优选在120～180℃下干热灭菌4～6小时。在上述抗草甘膦棉花的快速鉴定方法中，所述的草甘膦优选为农达（Roundup），其含有41%草甘膦异丙胺盐，由美国孟山都公司生产。应用本申请的鉴定方法对抗草甘膦棉花进行鉴定，具有以下优点：（1）周期短，一般8天左右即可获得鉴定结果。与田间或温室抗性鉴定方法相比，鉴定周期缩短了35天左右。（2）工作量小。本申请的鉴定方法在室内完成，无需进行整地、播种、施药等操作，一人便可完成整个鉴定过程。并且占用空间小，可以同时对多个材料进行鉴定。（3）不受季节限制。本申请的鉴定方法在室内操作，种子在光照培养箱中培养。与田间或温室抗性鉴定方法相比，本申请的鉴定方法避免了不良气候的影响。因此，本申请的鉴定方法可以重复进行，结果一致性较好。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本发明作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本发明的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本发明来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用来限制本发明的范围。下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ga.i.的含义为有效成分含量。实施例材料与方法材料：试验的抗草甘膦棉花材料共8种，分别为KCM1、KCM2、KCM3、KCM4、KCM5、KCM6、KCM7、KCM8；非抗草甘膦棉花材料共7种，分别为中棉所41、中棉所43、中棉所49、中棉所52、中棉所63、中棉所69、中棉所79，上述材料均由中国农业科学院棉花研究所育种室提供。使用的草甘膦为农达（Roundup），其含有41%草甘膦异丙胺盐，由美国孟山都公司生产。方法：催芽将所有棉花种子进行硫酸脱绒，光子处理备用。取每种待测材料的种子于清水中浸泡24小时，取已露白的种子备用。浸泡每个待测样本挑选已催芽露白的、饱满的棉花种子，用草甘膦溶液浸泡，随后用水冲洗。同时，设清水对照处理：用清水浸泡待测样本。砂培将细砂过筛后置于干燥箱中180℃下干热灭菌4小时，晾凉后将细砂和水按照重量比50kg：8kg的比例混匀，装入尺寸为13cm*19cm*12cm的发芽盒中，至2/3高度。将以上处理过的棉花种子均匀摆放于发芽盒中，每盒30粒种子，重复3次。然后在种子上覆盖约1.5cm的松散砂，盖上盖子后置于光照培养箱中培养。光照培养箱的设定条件为，温度30℃，湿度60%～80%，光照与黑暗比为8小时：16小时，光照强度6000lx。统计和计算砂培7天后，统计清水处理和草甘膦处理的棉花种子的出苗数，计算出苗率，统计胚根长，并计算胚根生长抑制率。其中种子出苗的判断标准为子叶破土。胚根生长抑制率%的计算公式是：胚根生长抑制率%=(清水对照组的胚根长-草甘膦处理组的胚根长)×100/清水对照组的胚根长实施例1抗草甘膦棉花材料（KCM1、KCM2、KCM3）和非抗草甘膦棉花材料（中棉所49、中棉所79），分别用浓度为4.1ga.i./L、6.15ga.i./L和8.2ga.i./L的草甘膦溶液浸泡1小时和2小时，实验结果列于表1。表1经草甘膦不同浓度不同时间处理后待测棉花种子的出苗率和胚根生长抑制率ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>胚根生长抑制率为负值表示草甘膦处理组的胚根长大于清水对照组，说明草甘膦处理对胚根生长无影响。由表1可知，用4.1gxa0a.i./L草甘膦溶液浸泡待测棉种1~2小时后，3种抗草甘膦棉花的出苗率为82.2%-93.3%，与清水对照（94.4%-97.8%）相比差异不大；胚根生长抑制率低于16.9%；而2种非抗草甘膦棉花的出苗率仅为8.9%-27.8%，与清水对照（77.8%-98.9%）相比差异大；胚根生长抑制率达80.8%以上。用6.15ga.i./L草甘膦溶液浸泡待测棉种1~2小时后，3种抗草甘膦棉花的出苗率为75.6%-82.2%，与清水对照（94.4%-97.8%）相比差异不大；胚根生长抑制率低于25.8%；而2种非抗草甘膦棉花的出苗率仅为1.1%-16.7%，与清水对照（77.8%-98.9%）相比差异大；胚根生长抑制率达80.1%以上。用8.2gxa0a.i./L草甘膦溶液浸泡待测棉种1~2小时后，3种抗草甘膦棉花的出苗率为73.3%-86.7%，与清水对照（94.4%-97.8%）相比差异不大；胚根生长抑制率低于18.6%；而2种非抗草甘膦棉花的出苗率仅为1.1%-10.0%，与清水对照（77.8%-98.9%）相比差异大；胚根生长抑制率达82.6%以上。由此可见，在4.1~8.2gxa0a.i./L的草甘膦溶液浓度下，本申请使用的草甘膦处理对非抗草甘膦棉花与抗草甘膦棉花的影响有明显区别，从而，本申请的鉴别方法能够有效地区分非抗草甘膦棉花与抗草甘膦棉花。实施例2抗草甘膦棉花材料（KCM4、KCM5、KCM6、KCM7、KCM8）和非抗草甘膦棉花材料（中棉所41、中棉所43、中棉所52、中棉所63、中棉所69），用8.2gxa0a.i./L草甘膦溶液浸泡处理1小时，实验结果列于表2。表2处理后待测棉花种子的出苗率、胚根长和胚根生长抑制率ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>根据表2的数据可以看出，对非抗草甘膦棉花材料，草甘膦处理显著影响出苗率（出苗率从72.2%~92.2%降低至4.4%~14.4%），胚根生长抑制率高达75.5%~81.3%；而对抗草甘膦棉花材料，草甘膦处理对出苗率影响不大（出苗率从95.6%~100%降低至75.6%~93.3%），胚根生长抑制率仅为0.2%~7.6%。由此可见，本申请使用的草甘膦处理对非抗草甘膦棉花与抗草甘膦棉花的影响有显著区别，从而，本申请的鉴别方法能够有效地区分非抗草甘膦棉花与抗草甘膦棉花。综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，因此，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。